Recombinant Hybrid Proteins as Biospecific Reporters for Bioluminescent Microassay

Abstract

Светоизлучающие белки – люциферазы и фотопротеины – широко используются как репортеры для высокочувствительного молекулярного анализа in vitro и in vivo. Соединение (конъюгирование) люциферазы с молекулами, обладающими аффинностью к определенным мишеням (иммуноглобулинами, олигонуклеотидами, гаптенами и пр.), обеспечивает специфичность анализа. Такие молекулы (биоспецифические биолюминесцентные метки) получают химическим синтезом на основе различных коммерчески доступных реагентов, которые взаимодействуют с функциональными группами на поверхности молекул. Однако такой синтез не может обеспечить получение гомогенного аддукта, вызывает потерю (иногда значительную) функциональной активности «сшиваемых» молекул. Как правило, при получении конъюгатов химическим способом проводят длительные поиски условий синтеза (соотношение реагентов, рН и температура среды, время проведения анализа и т.п.), которые позволяют максимально уменьшить негативные последствия влияния химических реагентов и при этом иметь удовлетворительный выход целевых конъюгатов. Другим способом получения биоспецифических меток является создание гибридных молекул с помощью генетической инженерии. Для этого получают генетическую конструкцию, в которой в одной рамке считывания последовательно находятся гены, кодирующие биоспецифический и репортерный белки, а также последовательности, кодирующие соединительный линкер, и часто различные вспомогательные полипептиды. Генетический фьюзинг обеспечивает доступную бактериальную экспрессию, гомогенность гибридных молекул, простые способы очистки с помощью вспомогательных полипептидных фрагментов и т.д. В данной работе описан ряд гибридов «люцифераза–биоспецифический белок», созданных в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, их дизайн, получение и применение в качестве биоспецифических биолюминесцентных меток в микроанализе