Са<sup>2+</sup>-регулируемый фотопротеин обелин как N-концевой партнер при конструировании слитых белков
View/ Open:
URI (for links/citations):
https://elib.sfu-kras.ru/handle/2311/2248Author:
Еремеева, Е.В.
Eremeeva, Elena V.
Франк, Л.А.
Frank, Ludmila A.
Маркова, С.В.
Markova, Svetlana V.
Высоцкий, Е.С.
Vysotski, Eugene
Date:
2010-12Abstract:
Са<sup>2+</sup>-регулируемые фотопротеины, генетически слитые с биоспецифическими полипептидами,
широко используются как репортеры для внутриклеточного мониторинга Са<sup>2+</sup>, а также в
анализе in vitro. Ранее было показано, что модификации фотопротеина акворина по С-концу
приводят к потере его биолюминесцентной активности, поэтому химерные белки получали
только присоединением полипептида к его N-концу. В представленной работе исследуется
возможность получения слитых белков по С-концу другого фотопротеина - обелина. При этом
вначале обелин (OL) генетически удлинили на одну аминокислоту - тирозин (Y), а затем получили
обелин, слитый через длинный гибкий линкер (31 аминокислота) с зеленым флуоресцентным
белком медузы Clytia gregaria (cgreGFP). Оба белка (OL-Y и OL-cgreGFP) были выделены, их
основные свойства изучены. Показано, что OL-Y образует устойчивый фотопротеиновый комплекс, биолюминесцентная активность которого составляет 75 % активности обелина
дикого типа (WT-OL). Активность OL-cgreGFP составляет 46 % от активности WT-OL. При
запуске биолюминесцентной реакции ионами кальция наблюдается эффективный резонансный
перенос энергии, в котором обелиновая часть химерного белка является донором, а cgreGFP -
акцептором энергии. Таким образом установлено, что репортерные молекулы на основе
Ca<sup>2+</sup>-регулируемого фотопротеина обелина могут быть получены генетическим слиянием с
биоспецифическими полипептидами по его С-концу. Ca<sup>2+</sup>-regulated photoproteins genetically fused with biospecific polipeptides have been extensively
used in intracellular Ca<sup>2+</sup> measurements and in the development of binding assays. Gene fusions to
aequorin have been limited to its N-terminus, since as previous studies indicated the protein loses
bioluminescent activity upon modification of its C-terminus. To investigate this in regard to another
photoprotein - obelin (OL) the one was elongated at its C-terminus with tyrosine (Y) and then fused
with green fluorescent protein Clytia gregaria (cgreGFP) through the flexible 31 aa linker. Both
proteins (OL-Y and OL-cgreGFP) were isolated and investigated. The OL-Y was found to form a
stable photoprotein comlex, possessing 75 % of WT-OL bioluminescent activity. OL-cgreGFP activity
preserves 46 % of WT-OL activity and demonstrates an effective resonance energy transfer, where
OL-partner and cgreGFP-partner are energy donor and acceptor respectively. Thus, it was shown
that the labels on the base of Ca<sup>2+</sup>-regulated photoprotein obelin may be obtained by fusing with biospecific
polypeptides regardless its termini.