Клонирование и характеристика полигидроксибутиратсинтазы из Methylobacterium extorquens AM1

Abstract

В результате поиска генов, кодирующих вероятные ПГБ-синтазы в геномах бактерий рода Methylobacterium, выявлены множественные (до пяти у одного штамма) гены ПГБ-синтаз. Филогенетическим анализом показано, что белки PhaC1, PhaC2, PhaC3 относятся к I классу ПГБ-синтаз, белки PhaC4 – к ПГБ-синтазам III класса, тогда как PhaC5, по-видимому, представляет неохарактеризованный класс ПГБ-синтаз. Впервые выделена и охарактеризована рекомбинантная ПГБ-синтаза I класса (КФ 2.3.1.B2) из Methylobacterium extorquens AM1, кодируемая геном phaC1. Молекулярная масса мономера фермента составила 78 кДа. Константа Михаэлиса (Km) для PhaC1 из штамма AM1 составила 1,3 мМ, а максимальная скорость реакции (Vmax) – 0,1 мкмоль∙мин-1∙мг-1. Получен делеционный мутант Methylobacterium extorquens по гену phaC, перспективный для дальнейшего исследования особенностей биосинтеза ПГБ метилобактериями

Multiple genes encoding putative PHB synthases (up to 5 in single strain) were found in Methylobacterium genomes. As a result of phylogenetic analysis proteins PhaC1, PhaC2, PhaC3 were identified as class I PHB synthases, PhaC4 proteins were identified as class III PHB synthases, while PhaC5 apparently belongs to uncharacterized class of PHB synthases. Firstly, the recombinant class I PBH synthase (EC 2.3.1.B2) encoded by phaC1 gene from Methylobacterium extorquens AM1 was purified and characterized. Molecular mass of enzyme monomer was 78 kDa. Michaelis constant (Km) for PhaC1 was 1,3 mM and maximal reaction rate (Vmax) was 0,1 μmol∙min–1∙mg–1. The deletion mutant of Methylobacterium extorquens in the phaC gene was obtained which is promising for further study of peculiarities of methylobacteria’s PHB biosynthesis