Bioluminescent Binding Microassay Using Aptamers as Biospecific Elements

Abstract

High specificity is an important requirement for an analytical system aimed at identifying a specific molecular target. Traditionally, antibodies, haptens and some other molecules are used for this purpose. Recently, aptamers were proposed as biospecific elements. Aptamers are short single-stranded oligonucleotides with a unique spatial structure that enables them to recognize target molecules and bind to them. Aptamers are obtained from synthetic random DNA(RNA)-libraries, a pool of oligonucleotides of the same length with different base sequences (1014-1015 variants), by selecting the oligonucleotides that are capable of specific binding to a given target. Aptamers are stable molecules with high affinity and specificity; they can be developed for any target, including toxic and nonimmunogenic ones; and they can be easily synthesized chemically. Due to these useful qualities, aptamers are often considered to be an alternative to antibodies. This paper describes the use of aptamer sensors and a highly sensitive bioluminescent reporter, the Ca2+-regulated photoprotein obelin, for the detection of diagnostically important targets in the blood of patients. Additionally, obelin was successfully applied as a reporter in the process of obtaining aptamers. A proposed bioluminescent solid-phase assay enables the enrichment of the oligonucleotide library with target-specific oligonucleotides to be monitored rapidly, the affinity of individual aptamers and their shortened variants to be evaluated and the relative position of the aptamers on the target molecule to be determined. The results of the studies reviewed in this paper open promising avenues for developing analytical systems that include highly specific aptamer sensing, as well as highly sensitive detection based on bioluminescent reporter proteins

Важнейшим качеством аналитической системы, направленной на выявление определенной молекулярной мишени, считается высокая специфичность. Традиционно для этого используют антитела, гаптены и пр. Сравнительно недавно в качестве биоспецифических элементов были предложены аптамеры – короткие одноцепочечные олигонуклеотиды, обладающие уникальной пространственной структурой, благодаря чему способные «распознавать» и специфическим образом связываться с молекулами-мишенями. Аптамеры получают из синтетических рандомных ДНК(РНК)-библиотек, совокупности олигонуклеотидов одинаковой длины с разной последовательностью оснований (1014-1015 вариантов), путем отбора тех, что способны специфическим образом связываться с данной мишенью. Аптамеры стабильны, обладают высокой аффинностью и специфичностью, их можно получать к любым мишеням, в том числе неиммуногенным и токсичным, их легко синтезируют химически. Благодаря этим преимуществам аптамеры часто рассматривают как альтернативу антителам. В данной работе описаны случаи применения аптамерной сенсорики и высокочувствительного биолюминесцентного репортера – Са2+-регулируемого фотопротеина обелина для выявления диагностически важных мишеней в крови пациентов. Этот же репортер предложено использовать при получении новых аптамеров. Разработанный оригинальный биолюминесцентный твердофазный анализ позволяет быстро отслеживать процесс обогащения синтетических библиотек специфичными к данной мишени олигонуклеотидами, оценивать аффинность полученных индивидуальных аптамеров и их укороченных вариантов, а также взаимное расположение аптамеров на молекуле-мишени. Результаты рассмотренных в работе исследований показывают перспективность разработки аналитических систем, включающих, с одной стороны, высокоспецифичную аптамерную сенсорику, а с другой – высокочувствительную детекцию на основе биолюминесцентных репортерных белков