Show simple item record

Kirillova, Maria A.en
Esimbekova, Elena N.en
Ranjan, Rajeeven
Torgashina, Irina G.en
Kratasyuk, Valentina A.en
Кириллова, М.А.ru_RU
Есимбекова, Е.Н.ru_RU
Ранджан, Рru_RU
Торгашина, И.Г.ru_RU
Кратасюк, В.А.ru_RU
2018-07-06T05:18:55Z
2018-07-06T05:18:55Z
2018-06
https://elib.sfu-kras.ru/handle/2311/71720
Microbial contamination is usually analyzed using luciferin-luciferase system of fireflies by the detection of adenosine-5’-triphosphate (ATP). There is an opportunity to assess the bacterial contamination of various objects based on a quantitative analysis of other nucleotides. In the present study, a bioluminescent enzyme system of luminous bacteria NADH:FMN-oxidoreductase (Red) and luciferase (BLuc) was investigated to understand if it can be used for quantitative measurements of bacterial cells by nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin mononucleotide (FMN) detection. To increase the sensitivity of bioluminescent system to FMN and NADH, optimization of assay conditions was performed by varying enzymes and substrates concentrations. The lowest limits of detection were 1.2 nM FMN and 0.1 pM NADH. Escherichia coli cells were used as a model bacterial sample. FMN and NADH extraction was made by destructing cell membrane by ultrasonication. Cell suspension was added into the reaction mixture instead of FMN and NADH, and light intensity depended on number of bacterial cells in the reaction mixture. Centrifugation of sonicated sample as an additional step of sample preparation did not improve the sensitivity of method. The experimental results showed that Red and BLuc system could detect at least 800 thousand bacterial cells mL-1 by determining concentration of NADH extracted from lysed cells, while 3.9 million cells mL-1 can be detected by determining concentration of FMNen
Для анализа микробного загрязнения широко используется биолюминесцентный метод, основанный на определении аденозин-5’-трифосфата (АТР) с помощью люциферин- люциферазной системы светляков. Существует принципиальная возможность оценки степени бактериальной обсемененности различных объектов исходя из количественного анализа других нуклеотидов. В работе исследована возможность применения биолюминесцентной системы светящихся бактерий NADH:FMN-оксидоредуктаза (Red) и люцифераза (BLuc) для количественного анализа бактериальных клеток путем определения количества никотинамидадениндинуклеотида (NADH) и флавинмононуклеотида (FMN) в образце. Для увеличения чувствительности биолюминесцентной системы к FMN и NADH осуществлена оптимизация условий проведения анализа путем подбора концентраций ферментов и субстратов в реакционной смеси. Максимальная чувствительность биферментной системы Red + BLuc составила 1,2 нМ FMN и 0,1 пМ NADH. Для проведения количественного анализа бактериальных клеток использовали модельный бактериальный образец – культуру Escherichia coli. Экстрагирование FMN и NADH проводили путем разрушения клеточной мембраны ультразвуковым дезинтегратором. Клеточную суспензию добавляли в реакционную смесь вместо раствора FMN или NADH, при этом интенсивность свечения биолюминесцентной системы зависела от количества бактериальных клеток в реакционной смеси. Введение в пробоподготовку дополнительной процедуры центрифугирования образца, подвергнутого ультразвуковой обработке, не привело к увеличению чувствительности метода. Таким образом, было показано, что чувствительности биферментной системы Red + BLuc достаточно для определения не менее 800 тыс бактериальных клеток в миллилитре путем экстрагирования NADH из разрушенных клеток. При анализе, основанном на определении концентрации FMN в бактериальном образце, чувствительность метода составила 3,9 млн клеток на миллилитрru_RU
enen
Сибирский федеральный университет. Siberian Federal Universityen
NADH:FMN-oxidoreductaseen
bacterial luciferaseen
bacterial contaminationen
Escherichia colien
NADH:FMN-оксидоредуктазаen
бактериальная люциферазаru_RU
бактериальное загрязнениеru_RU
Escherichia coliru_RU
Bioluminescent System of Luminous Bacteria for Detection of Microbial Contaminationen
Биолюминесцентная система светящихся бактерий для анализа микробного загрязненияru_RU
Journal Articleen
Kirillova, Maria A.: Siberian Federal University 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041, Russiaen
Esimbekova, Elena N.: Siberian Federal University 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041, Russia; Institute of Biophysics SB RAS FRC “Krasnoyarsk Science Center SB RAS” 50/50 Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russia; esimbekova@yandex.ruen
Ranjan, Rajeev: Siberian Federal University 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041, Russiaen
Torgashina, Irina G.: Siberian Federal University 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041, Russiaen
Kratasyuk, Valentina A.: Siberian Federal University 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041, Russia; Institute of Biophysics SB RAS FRC “Krasnoyarsk Science Center SB RAS” 50/50 Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036, Russiaen
Кириллова, М.А.: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79ru_RU
Есимбекова, Е.Н.: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79; Институт биофизики СО РАН ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН» Россия, 660036, Красноярск, Академгородок, 50/50ru_RU
Ранджан, Р: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79ru_RU
Торгашина, И.Г.: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79ru_RU
Кратасюк, В.А.: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79; Институт биофизики СО РАН ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН» Россия, 660036, Красноярск, Академгородок, 50/50ru_RU
174-180ru_RU
Журнал Сибирского федерального университета. Биология. Journal of Siberian Federal University. Biology; 2018 11 (2)en


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record


DSpace software copyright © 2002-2015  DuraSpace
Theme by 
@mire NV