Differentiation of BMSCs into Nerve Precursor Cells on Fiber-Foam Constructs for Peripheral Nerve Tissue Engineering

Abstract

Bone marrow stem cells (BMSCs) are frequently used in nerve tissue engineering studies due to ease of their isolation and high potential for differentiation into nerve cells. A bilayer fiber-foam construct containing nanofibrous elements to house and guide BMSCs was designed as a model to study the regeneration of damaged peripheral nerve tissue and eventually serve as a nerve guide. The construct consisted of a) a macroporous bottom layer to serve as the backing and support, and for nutrient transport, and b) an electrospun, fibrous upper layer for cell attachment and guidance. Porosity and pore sizes of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (PHBV) bottom layer were 85% and 5-200 μm, respectively, suitable for cell attachment and growth. Alignment of the cells is essential for cell-to-cell contact and the degree of alignment of electrospun PHBV/Collagen fibers was 11° when a frame type collector was used, while it was much higher (53°) for random fibers produced on an ordinary aluminum sheet collector. When the fibers were electrospun directly onto a PHBV foam attached on the frame type collector to create the bilayer, the degree of alignment of fibers decreased, alignment angle increased from 11° to 44°. This value did not change when the fibers were electrospun directly on the foams on the aluminum collector (53° vs 55°). A new media was designed to achieve comparable differentiation with the commercial media. It was found that the commercial Mesenchymal Stem Cell Neurogenic Differentiation Medium (PromoCell, Germany) was the better in terms of the expressions of neuronal markers nestin and β-III tubulin and the medium made in the lab with known constituents led to neuronal marker expressions very close to that with the commercial medium. Attachment and proliferation of the rBMSCs were higher on the random fiber mats, while alignment of cells was higher on the aligned fibers. In conclusion, the bilayer construct with aligned PHBV-collagen fibers on a PHBV foam was found to be more appropriate for peripheral nerve repair when used as a nerve guide

Стволовые клетки костного мозга (СК КМ) часто используются в исследованиях нервной ткани в связи с легкостью их выделения и высоким потенциалом для дифференцировки в нервные клетки. Двухслойная конструкция из волокон и губки, содержащая нановолоконные элементы для прикрепления СК КМ и их направленной дифференцировки, была разработана в качестве модели для изучения процессов регенерации поврежденной периферической нервной ткани и использования со временем в качестве нервного проводника. Разработанная конструкция состояла из: а) макропористого нижнего слоя, который служил основой и опорой, а также участвовал в переносе питательных веществ, и б) волокнистого верхнего слоя, полученного методом электроспиннинга, для прикрепления клеток и направленной дифференцировки. Пористость и размеры пор нижнего слоя поли-3-гидроксибутирата-3-гидроксивалерата (ПГБВ) составляли 85 % и 5-200 мкм соответственно, что способствовало прикреплению и росту клеток. Ориентация клеток имеет большое значение для межклеточного контакта. Степень выравнивания волокон ПГБВ/коллагена составляла 11° при использовании коллектора типа рамы, и была намного выше (53°) для волокон со случайной ориентацией, полученных при сборе на обычный алюминиевый листовой коллектор. Если во время электроспиннинга волокна наносили непосредственно на губку ПГБВ, прикрепленную к коллектору типа рамы чтобы создать двойной слой, степень выравнивания волокон уменьшалась, угол выравнивания увеличивался с 11 до 44°. Когда волокна наносили на губку, закрепленную на алюминиевом листовом коллекторе, степень выравнивания волокон практически не менялась (53 против 55°). Была разработана новая среда с целью достичь дифференцировки клеток, сопоставимой с дифференцировкой в коммерческих средах. Было обнаружено, что коммерческая среда нейрогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток (PromoCell, Германия) была лучше с точки зрения экспрессии нейронных маркеров нестина и β-III тубулина. Результаты экспрессии нейронных маркеров на среде известного состава, полученной в лаборатории, были близки к результатам, полученным на коммерческой среде. Прикрепление и пролиферация СК КМ были выше на волокнах со случайной ориентацией, тогда как выравнивание клеток было лучше на волокнах с упорядоченной ориентацией. Таким образом, было установлено, что двухслойная конструкция с упорядоченными волокнами ПГБВ/коллаген на губке из ПГБВ более подходит для регенерации периферических нервов при использовании в качестве нервного проводника