Тест-система для выявления вируса клещевого энцефалита биолюминесцентным иммуноанализом

Abstract

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) является инфекционным агентом тяжелого нейрозаболевания – клещевого энцефалита. Он переносится иксодовыми клещами, инфекция распространена по всей лесной и лесостепной зоне умеренного пояса Евразийского континента, в том числе в Сибирском регионе Российской Федерации. Несмотря на наличие коммерческих аналитических систем для выявления ВКЭ, задача разработки быстрых и достоверных методов анализа, пригодных для рутинного применения, в том числе и при экологических исследованиях, остается актуальной. В результате проведенных исследований разработана и испытана тест-система для выявления вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в клещах твердофазным биолюминесцентным иммуноанализом. В качестве сенсора использовали гибридный белок, состоящий из одноцепочечного мини-антитела мыши к вирионному белку Е и термостабильного варианта люциферазы Renilla muelleri. Этот уникальный белок был получен и исследован авторами ранее. В работе рассмотрены варианты экспрессии гибрида рекомбинантными клетками E. coli разных штаммов и найдены оптимальные условия получения высокоочищенного препарата этого белка. Запуск биолюминесцентной реакции люциферазного домена осуществляли с помощью стабильной природной формы субстрата – Са2+-зависимого целентеразин-связывающего белка, рекомбинантый вариант которого был получен авторами ранее. Найдены условия долгосрочного хранения ключевых элементов системы – гибридного белка, стабильной формы субстрата люциферазы, активированных планшетов. Анализ осуществляется в высокопроизводительном микропланшетном варианте. Разработанным способом исследовано более 900 образцов природных клещей. По чувствительности (89,5 %) и специфичности (98,9 %) биолюминесцентный анализ не уступает колориметрическому, будучи при этом проще и быстрее

The tick-borne encephalitis virus (TBEV) is the causative agent of one of the most severe human neuroinfections. The infection transmitted by ixodid ticks is spread throughout the forest and foreststeppe zones of the temperate climatic belt of the Eurasian continent, including the Siberian region of the Russian Federation. Despite the availability of commercial analytical systems for the detection of TBEV, the task of developing approaches to a quick and reliable analysis that can be performed routinely, particularly in environmental studies, remains topical. A solid-phase bioluminescent immunoassay for determining the tick-borne encephalitis virus (TBEV) in ticks was developed. The assay is based on the hybrid protein consisting of a modified thermostable version of Renilla muelleri luciferase and a single-chain mini-antibody to protein E. This unique protein had been obtained and investigated by the authors earlier. The current study describes the expression of the hybrid protein in two different strains of recombinant E. coli cells. The optimal conditions for obtaining a highly purified protein were found. The bioluminescent reaction of the luciferase domain was triggered with the help of the stable natural form of the substrate, a Ca2+-dependent coelenterazine-binding protein, the recombinant variant of which was obtained by the authors. The conditions for production and storage of the immunoassay components (the hybrid protein, the stable form of the luciferase substrate, and activated microplates) were determined. Using the developed test system, more than 900 tick samples were analyzed for TBEV. In terms of sensitivity (89.5%) and specificity (98.9%), the proposed method is not inferior to colorimetric detection and is much simpler and faster than the latter