Разработка способа получения функционально активного рекомбинантного стрептавидина в клетках Escherichia coli

Abstract

Стрептавидин – гомотетрамерный белок, продуцируемый Streptomyces avidinii, каждая субъединица которого связывает биотин (витамин H) с образованием стабильного комплекса (Kd = 10-15 М). Стрептавидин-биотиновое взаимодействие используют в аналитических системах, для адресной доставки соединений, для аффинной очистки веществ и т.д. Цель данного исследования – разработать рациональный способ получения рекомбинантного функционально активного стрептавидина. Сконструированы штаммы Esherihia coli – продуценты минимального корового и полноразмерного вариантов стрептавидина с использованием одной и той же экспрессирующей системы – E. coli BL21 Codon plus (DE3) RIPL в качестве клеток- хозяев и плазмиды pET19b, несущей ген минимального (miniSAV) или полноразмерного (SAV) стрептавидина. Экспрессия miniSAV сопровождается его локализацией в E. coli в виде нерастворимых телец включения. С 1 л культуры было получено 130 мг высокоочищенного денатурированного белка. Выход функционально активного белка после рефолдинга составил 10- 15 %. Полноразмерный стрептавидин синтезируется в растворе цитоплазмы, но его токсичность обусловливает низкий выход (10-13 мг с 1 л культуры) этого белка при стандартных условиях культивирования. Установлено, что индукция синтеза SAV в конце логарифмической фазы роста культуры обеспечивает выход функционально активного белка 30 мг с 1 л культуры. Препарат высокоочищенного SAV получали одностадийной аффинной хроматографией на 2-иминобиотин- агарозе. Колориметрическим анализом с использованием красителя НАВА (4-гидроксиазобензол- 2-карбоновой кислоты) определено, что одна молекула SAV связывает 3,9 молекулы биотина. Штамм E. coli BL21 Codon Plus (DE3) RIPL/pET19bSAV стабилен при хранении с добавлением 20 % глицерина при минус 70 °С, что подтверждено многократными пересевами в течение 2 лет. Показана применимость обоих вариантов стрептавидина для образования высокоспецифичных комплексов между биотинилированными молекулами в условиях твердофазного микроанализа сэндвич-типа. Штамм-продуцент рекомбинантного стрептавидина (E. coli BL21 CodonPlus (DE3) RIPL/pET19bSAV) хранится в коллекции экстремофильных и типовых культур ИХБФМ СО РАН (Новосибирск), № КЭМТК 3505. Разработанный способ получения рекомбинантного функционально активного стрептавидина обеспечивает его доступность для биотехнологических исследований

Streptavidin is a homotetrameric protein produced by Streptomyces avidinii, each subunit of which binds biotin (vitamin H), forming a stable complex (Kd = 10-15 М). Streptavidin-biotin coreaction is widely used in analytical systems, for targeted delivery of compounds, for affinity purification, etc. The aim of this study was to develop a rational technique to produce functionally active recombinant streptavidin. Recombinant Escherichia coli strains producing minimal core and full-sized streptavidin variants were obtained. The E. coli BL21 Codon Plus (DE3) RIPL, as host cells, and the pET19b plasmid carrying gene of minimally-sized core (miniSAV) or full-sized (SAV) streptavidin were used. Synthesis of miniSAV results in its localization as insoluble inclusion bodies. Denatured miniSAV yield was 130 mg per liter of E. coli c ulture. T he r enaturation g ives o nly 10- 15 % of the functionally active protein. Full-sized streptavidin localizes in the cytoplasm in a soluble state, but its toxicity causes low yield of the protein (10-13 mg per liter of the culture). The induction of SAV synthesis at the end of the logarithmic stage of cell growth was found to increase the yield of SAV approximately 2-fold. The yield of functionally active protein was 30 mg per liter culture. SAV was produced practically in individual state after affine chromatography on 2-iminobiotin agarose. One molecule of full-sized streptavidin bound 3.9 biotin molecules as was shown by colorimetric analysis using HABA (4-hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid). Both streptavidins form sandwichtype complexes with biotinylated molecules in solid-phase microassay conditions. E. coli BL21 Codon Plus (DE3) RIPL/pET19bSAV strain was stable during storage with 20 % glycerol at -70 °С, which was shown by repeated two-year reseeding. The streptavidin producing strain (E. coli BL21 Codon Plus (DE3) RIPL/pET19bSAV) is deposited in the Collection for extremophile microorganisms and type cultures (Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS, Novosibirsk), No. 3505. The method for producing functionally active recombinant streptavidin developed in this study ensures its availability for biotechnological research